Space Ranger 軟件提供功能： 一種是自動對齊（只需要提供圖片文件），另外一種是手動對齊（除了需要提供圖片文件，還需要提供圖像組織位置跟 spot 對應信息的 json 文件）。本文帶你一分鐘了解 10x 空間轉錄組 Visium 的 圖像手動對齊 應該怎樣做？
Space Ranger 管線使用 自動圖像檢測算法 來計算基準標記的位置，并找到組織的邊界。10x Genomics 在各種各樣的 H & E 圖像，組織和樣本上測試了該算法，并發現檢測算法是可靠的。但是，對于免疫熒光圖像，或在基準標記物模糊或組織邊界不清楚的情況下，將需要手動進行基準對準和組織概述。
其實除了圖像模糊邊界不清楚之外還有一些情況需要考慮手動調整圖像，比如說有少量組織碎片掉在了載玻片其他位置上，不去除的話圖像上某個角落里出現一個或幾個孤零零的點太影響美觀，另外比如說組織上有臟的地方，或者某塊區域有粘膜擋住了也可以通過手動的方式把這些地方去除掉。
使用 Loupe Browser（需 4.0 以上版本） 來進行手動對齊
如果沒有安裝 Loupe Browser 需要先安裝一下，下載地址跟 Space Ranger 是同一個，直接點擊下載就好了。
https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest
1：打開 Loupe Browser
Visium 手動對齊向導在 LoupeBrowser 開始頁面的左下方，找到 Align a VisiumImage
2：點擊 Align a Visium Image
單擊鏈接將啟動向導。向導的首頁顯示了 Visium 載玻片的示意圖，包括幻燈片上序列號的位置以及載玻片上每個捕獲區域的位置。
第三步：導入圖片
點擊 InputAlignment Data，進入圖片導入界面。
點擊 Open Image 導入圖片，可以提供 TIFF 或者 JPEG 圖像文件，如果提供的 TIFF 圖像特別大的話有可能花的時間會比較久甚至直接導不進去，建議使用 JPEG 圖像文件。
10x 官網提供了一個示例文件，大家如果還沒有自己的圖像文件可以拿這個文件先試試。
●圖片：下載
●slide 序列號：V19L29-035
選擇載玻片 slide 序列號和捕獲區域
輸入載玻片信息有三個選項：
1、默認直接輸入載玻片序列號和圖像的捕獲區域。此選項需要聯網，因為需要從 10x 官網下載較新的 slide 信息文件。
2、已經下好了 slide 文件，比如 V19L29-035.gpr，點擊第二個選項是會提示選擇對應的 slide 文件。第二個選項更適合脫機模式。
3、如果圖像的序列號和捕獲區域未知或不可用，仍然可以使用第三個選項進行手動對齊。Visium 手動對齊向導會使用理想化的網格布局來代替對齊步驟，而不是特定于載玻片的 slide 點偏移文件。從理想柵格到實際滑動位置的每個點的增量可能在 5 到 15 微米之間，大大小于每個點的寬度。斑點精度有些損失，但是斑點與基礎圖像之間的關系仍然是連貫的。
第四步：將 spot 點與圖像對齊
這一步主要是標記四個角，依次用鼠標點擊上面四個形狀的中心內，注意順序不要錯，每次軟件左邊會有提示標記哪個形狀。
四個角標記好之后會出現上述紅色邊框，看一下紅色邊框跟灰色圓點的位置對應關系，不要有比較大的偏移就好，一般不可能完全重疊起來，多少回有點偏移。如果覺得偏移太大，可以點擊 Clear Centers 清除原來的標記，重新再標記一次。
第五步：選取組織
上一步完成后點擊 Continue 進入選取組織步驟。
這里主要有下面一些工具：放大、縮小、移動、套索、babel 標記、橡皮擦等。
大部分情況我們只用套索工具就好了，用套索選擇要標記的區域然后標記為組織或是背景。
如果實在是想把整塊組織里某塊很小的區域標記為背景，用套索不太好操作，可以先把圖像放大，然后用橡皮擦來擦掉這塊區域，這樣就變成背景區域了。
整個組織標記完之后圖片是下圖這樣，標記為組織的是綠色，背景區域是灰色，點擊 Continue 進入下一步。
第六步：文件導出
點擊 Export 導出手動校準后的文件（后綴為。json），然后用于 spaceranger 管道中。
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