客戶單位： 廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院

期刊：Theranostics

影響因子：8.579

發(fā)表時間：2020.07.09

伯豪提供服務(wù)： 機(jī)器學(xué)習(xí)建模和免疫浸潤分析

具有完善基因表達(dá)數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)的大規(guī)模公共隊列為開發(fā)腫瘤預(yù)后標(biāo)志提供了可能。近年來，機(jī)器學(xué)習(xí)作為人工智能（AI）的分支，已經(jīng)被成功用于建立腫瘤患者預(yù)后和治療預(yù)測的模型。與此同時，近年來人們逐漸了解到腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性和多樣性，腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞相互作用，共同介導(dǎo)了腫瘤的免疫耐受，從而對腫瘤進(jìn)程及治療產(chǎn)生重要影響。在這項(xiàng)研究中，作者整合了多個隊列和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，開發(fā)驗(yàn)證了一個基于基因集的胃癌預(yù)后特征（GPSGC），然后進(jìn)一步分析 GPSGC 風(fēng)險評分與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系，探討了 GPSGC 評分相關(guān)的生存機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)了潛在的治療靶點(diǎn)。

（1）發(fā)現(xiàn)階段：對 TCGA 和 ACRG 數(shù)據(jù)庫中的癌和癌旁進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，進(jìn)一步通過 Cox 回歸分析初步獲得 22 個候選 marker。

（2）訓(xùn)練階段：進(jìn)一步應(yīng)用 Stepwise Cox regression multivariate 分析篩選出基因組合，構(gòu)建優(yōu)秀的多元 Cox 回歸模型。

risk score = (0.14121 * expression of VCAN) + (0.19095* expression of CLIP4) + (0.13633 * expression of MATN3)

利用 X -tile 軟件獲得的 cutoff（0.15），從而將 TCGA-STAD 和 ACRG 隊列中的患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。在 TCGA 隊列中，高風(fēng)險評分患者（22.8%）的總生存率（OS）較低風(fēng)險評分患者（77.2%）短（HR=2.296；95%CI:1.513-3.485；P<0.0001）；同樣的，在 ACRG 隊列中，高風(fēng)險患者（30.7%）的 OS 較低風(fēng)險患者（69.3%）短（HR=2.659；95%CI:1.836-3.849；P<0.0001）。

（3）驗(yàn)證階段：為了確定 GPSGC 是否穩(wěn)健，作者在三個獨(dú)立的 GEO 隊列中評估了 GPSGC 的性能，共包含 1057 名患者。與訓(xùn)練隊列的結(jié)果一致，根據(jù) GPSGC 被分配到高風(fēng)險組的患者在多個 GEO 驗(yàn)證隊列中的 OS 或 RFS 明顯比那些被分配到低風(fēng)險組的患者差。

為了探討 GPSGC 的預(yù)后價值是否獨(dú)立于其他臨床因素，作者進(jìn)行了多因素 Cox 回歸分析，結(jié)果表明，GPSGC 可以作為患者生存結(jié)局的獨(dú)立預(yù)測因子，從而證實(shí)了其獨(dú)立預(yù)測 GC 預(yù)后的穩(wěn)健性。

基于多變量 Cox 分析，生成了一個整合了 GPSGC 和其他臨床變量的列線圖，以預(yù)測 TCGA-STAD 和 ACRG 訓(xùn)練隊列的 GC 患者 3 年和 5 年總生存率的概率。

腫瘤微環(huán)境（TME）由細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、間質(zhì)細(xì)胞、免疫 / 炎癥細(xì)胞和分泌因子組成，與腫瘤的進(jìn)展和治療反應(yīng)密切相關(guān)。上述 GPSGC 風(fēng)險模型中，VCAN、CLIP4 和 MATN3 蛋白的組織分布和細(xì)胞定位表明它們與腫瘤微環(huán)境（TME）有關(guān)。

（1）TME subcomponent analysis

為了進(jìn)一步探討 GPSGC 背后的潛在機(jī)制，首先基于 ESTIMATE 算法將 TME 分為基質(zhì)和免疫亞組分，并通過 ssGSEA 確定基質(zhì)和免疫評分。Pearson 相關(guān)分析顯示，基質(zhì)評分與 GPSGC 風(fēng)險評分呈顯著正相關(guān)（r=0.645；P<1.0×10-6；）。此外，而基質(zhì)評分高的 GC 患者總體生存率比基質(zhì)評分低的患者差（HR=1.351；95%CI:1.107-1.647；P=0.0031）。

（2）TME cell type analysis

對于 TME 細(xì)胞類型分析，基于 xCell 算法預(yù)測 64 種 TME 細(xì)胞類型的比例，并通過 ssGSEA 確定每種細(xì)胞類型的富集分?jǐn)?shù)。在 64 種 TME 細(xì)胞類型中，與 OS（log-rank test, P <0.05）和 GPSGC 風(fēng)險評分（Pearson’s correlation test, |r| ≥ 0.40, P < 0.05）顯著相關(guān)的細(xì)胞共有 9 種類型。值得注意的是，占比大的五種間質(zhì)細(xì)胞均與預(yù)后和 GPSGC 風(fēng)險評分呈正相關(guān)。

（3）Panimmune gene set analysis

在泛免疫基因集分析中，利用 GSVA 對 110 條免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路的富集分?jǐn)?shù)進(jìn)行了估計，篩選與 OS（log-rank test, P <0.05）和 GPSGC 風(fēng)險評分（Pearson’s correlation test, |r| ≥ 0.40, P < 0.05）顯著相關(guān)的基因集，得到 10 個泛免疫基因集，其中 8 個與不良結(jié)局和 GPSGC 風(fēng)險評分呈正相關(guān)。

（4）immunomodulatory gene analysis

為了確定 GPSGC 相關(guān)的特異性分子靶點(diǎn)，在整個隊列中分析了 60 個免疫調(diào)節(jié)基因與 GPSGC 風(fēng)險評分的相關(guān)性（Pearson’s correlation test, |r| ≥ 0.40, P <0.05）；。OS 分析進(jìn)一步表明，只有三個免疫調(diào)節(jié)基因 VEGFB、TGFβ1 和 ENTPD1 顯著與不良結(jié)果相關(guān)。

由于所有與 GPSGC 和治療靶點(diǎn)相關(guān)的蛋白質(zhì)都具有重要的生物學(xué)功能，進(jìn)一步使用組織微陣列和多重?zé)晒饷庖呓M織化學(xué)（mfIHC）在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在 186 例 GC 患者的組織微陣列中，GPSGC 有效地將 59 名患者（31.7%）分為高危組，127 名患者（68.3%）分為低風(fēng)險組。OS 分析還證明治療靶點(diǎn) TGFβ1 和 VEGFB 的蛋白表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān)。VCAN、CLIP4 和 MATN3 的表達(dá)水平和與治療靶點(diǎn) TGFβ1 和 VEGFB 的表達(dá)顯著相關(guān)。Pearson 相關(guān)分析顯示，GPSGC 風(fēng)險評分與 TGFβ1 蛋白表達(dá)和 VEGFB 蛋白表達(dá)呈強(qiáng)正相關(guān)。

1、數(shù)據(jù)庫挖掘結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；

2、機(jī)器學(xué)習(xí)算法的運(yùn)用；

3、多層面免疫浸潤分析；

4、預(yù)后模型與免疫微環(huán)境的關(guān)聯(lián)分析。