單細胞基因表達 Flex 是 10x Genomics 于 2022 年 3 月推出的新產品（原 Fixed RNA），通過探針雜交的方式捕獲靶基因，再進行細胞捕獲建庫測序的新技術。該技術可鎖定 RNA 的瞬時表達狀態，解決了單細胞樣本儲存運輸、多樣本批量處理以及混樣測序的問題，讓單細胞轉錄組的研究更加靈活。

針對 FFPE 切片，使用二甲苯脫蠟，使用膠原酶、胰蛋白酶等多種酶來消化組織，制備單細胞懸浮液，進而抽核得到細胞核樣本；建庫時采用靶向基因的探針對雜交目標 RNA 分子后連接的原理，進而完成文庫構建的過程；該方法可以用來分析數千個至數萬個細胞核的基因表達，能夠對人或小鼠的 FFPE 樣本進行單細胞轉錄組分析。

單細胞基因表達 Flex 是基于探針雜交原理，簡單來說就是對已知序列設計探針，然后將成對的探針與 RNA 進行原位雜交，之后對探針進行擴增，然后用 Gel Beads 捕獲探針進行建庫測序。

 ▲上圖 單細胞基因表達 Flex 的探針雜交原理

首先，將 FFPE 樣本制備成細胞核懸液，然后加入探針進行探針的雜交。如果是多樣本混樣，則需要在雜交后對樣本進行等細胞數量的混合。混合計數之后取一定數量的細胞懸液進行上機捕獲，在 PCR 儀中進行探針的連接和延伸。隨后進行文庫的構建和測序到最后的數據分析。

▲上圖   單細胞基因表達 Flex 工作流程

單細胞 RNA 測序研究的范圍和規模正在不斷擴大，研究人員的目標是根據患者隊列或多個治療條件或時間點來分析更多的樣本。Chromium 單細胞基因表達 Flex 分析不僅能對新鮮樣本開展單細胞基因表達分析，還能對 PFA 固定樣本及 FFPE 細胞和組織進行分析。尤其是 Flex 技術實現了 FFPE 樣本在單細胞水平的研究，可以解鎖大量儲存在醫院以及生物樣本庫中的 FFPE 樣本的寶貴信息。

（1）擴大了樣本范圍：能對 FFPE 細胞和組織，以及 PFA 固定樣本進行單細胞測序分析，而不再受限于是否有新鮮組織可用，可以解鎖大量儲存在醫院以及生物樣本庫中的 FFPE 樣本的寶貴信息。

（2）簡化了工作流程：FFPE 樣本比較容易獲取，易運輸，并且樣本收集相對經濟成本低。使樣本采集更加靈活，實驗時間安排更加方便。

（3）提升了低表達基因檢測靈敏度：根據 Flex 和單細胞 3RNA 的實測數據對比結果，在多種樣本類型中，相同的測序數據量下，Flex 所得的測序數據飽和度更高，探針靈敏度更強，單個細胞內可以檢測到的基因數更多。

（4）與 10x Visium FFPE 空間轉錄組更配：Flex 技術與 10x 推出的 FFPE 空間轉錄組技術完美結合，能夠通過同一套探針對同一 FFPE 樣本進行單細胞轉錄組與空間轉錄組研究，基因表達一致性更高，數據聯合分析匹配性更好。

由于需要捕獲探針捕獲基因進行建庫，因此需要有配套的探針的物種才可以開展實驗。目前單細胞 Flex RNA 僅適用于人類和小鼠，并且只能進行基因表達應用（不能進行 ATAC-Seq 或 VDJ 測序）。對于 FFPE 樣本，由于受蠟塊年齡、組織類型、固定前組織質量、組織密度、組織面積以及其他因素的影響，致使相同面積和厚度的組織解離后獲取的細胞數量也會存在較大差異。

1、FFPE 樣本量要求

石蠟塊： 蠟塊被包埋組織體積需要 >0.5cm³

石蠟卷： 厚度 25μm 或 50μm 石蠟卷 3 卷以上，不可小于 25μm；被包埋組織橫截面積需 >0.3 cm² 蠟卷完整不破碎，放入 1.5ml EP 管中，4 度避光保存和運輸。石蠟卷如破碎較為嚴重，說明樣本脆性較大，會影響樣本質量。注：某些組織類型由于同等體積下細胞數量較少，可能需要提供更多蠟卷，例如穿刺樣本、脂肪組織、肺癌、心肌等。

FFPE 保存年限：無明確年限要求，10x Genomics 已測試過長達 11 年的樣本；已有文獻表明相對于保存時間，固定時間對 RNA 質量影響更大（Trinks A，2024；Yunxia Guo，2023）。

2、FFPE 組織切片的細胞產量

在單個孔中可以檢測多達 10,000 個細胞 / 核，即每個芯片最多可檢測 80,000 個細胞。然而，裝載的細胞或細胞核越多，可能出現的多胞率就越多。此外，更多的細胞意味著需要更高的測序數據量。一個常見的目標是每孔 8000 個細胞 / 核。10x 給出了一個樣本準備推薦表，給出了樣本類型，石蠟卷張數和橫切面面積，以及相對應的細胞核得率。在這個表的基礎上可以預估一下需要的蠟卷數量和厚度，最后兩列細胞核的數量是 10x 用他們自己的方法做出來的細胞得率，伯豪生物用的是自己研發的方法抽核，細胞核得率和質量更有保證。

圖 10x 給出的特定組織類型 / 切片的近似細胞產量

3、FFPE 組織核酸質量要求

核酸質檢需要 DV200>30%（DV200 指長度大于 200nt 的 RNA 片段占總的 RNA 片段的比例）

4、FFPE 樣本細胞核懸液的質控要求

因為要進行探針雜交，雜交結束要洗好幾遍，中間會損失很多細胞核。所以單細胞核懸液中的細胞核總數量要大于 30 萬個，而且核膜完整度 >80%，結團率 <10%。除此，還要求抽核后背景干凈雜質少，雜質多的話會拉低中位基因數同時會有游離 RNA 的污染。

▲上圖 解離后（左）和雜交后洗滌后的細胞計數（雜交后洗滌可減少碎片）

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