2020 年 11 月 26 日，Kiel University 在 Immunity（IF：21.5）上在線發(fā)表了一項研究，利用 14 名患者的多個外周血樣本分析了 bulk 轉(zhuǎn)錄組、bulk DNA 甲基化組和單細胞轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果顯示重度 COVID-19 患者的特點是增殖、代謝增強的漿母細胞增加，同時研究人員還發(fā)現(xiàn) IFN 激活的循環(huán)巨核細胞擴張，紅系生成增加，且具有缺氧信號的特征。巨核細胞和紅細胞衍生的共表達模式可能對疾病結(jié)果具有一定的預(yù)示功能。該研究表明 SARS-CoV- 2 感染影響了多種細胞的廣譜免疫功能。

1、實驗設(shè)計

14 個住院的 COVID-19 患者的 5 個外周血樣本，作者采用了 scRNA-seq（10x Genomics），單細胞 B 細胞受體（BCR），RNA-seq、DNA 甲基化分析和多重細胞因子 ELISA 分析（圖 1A）。作者使用了經(jīng)過修改的 WHO 序數(shù)量表，該量表還考慮了幾種炎癥標志物（血清 C 反應(yīng)蛋白 [CRP]，血清 IL- 6 和鐵蛋白），該分數(shù)用于對患者的病程進行分類（圖 1B 和 1C）。

圖 1 用于疾病軌跡分析的疾病階段的臨床定義

2、scRNA-seq 分析確定細胞分化軌跡

scRNA-seq 共得到 358,930 個細胞的數(shù)據(jù)，每個樣品平均有 10,900 個細胞；注釋得到 37 個不同的細胞亞群；聚類結(jié)果顯示單核細胞亞群中個體間的異質(zhì)性較高；跨時間點的計數(shù)揭示了幾種細胞類型的變化，包括單核細胞，增生性淋巴細胞和自然殺傷（NK）細胞，經(jīng)典 CD14 + 單核細胞的增加，尤其是在恢復(fù)期，而非經(jīng)典 CD16 + 單核細胞的數(shù)量在擬時序 2 和 3 都增加了，研究發(fā)現(xiàn) COVID-19 患者外周血中幾種源自骨髓的前體細胞類型的存在增加，并且在整個疾病過程中，巨核細胞（MK）比例明顯升高。

圖 2 沿擬時序結(jié)果 UMAP 展示

3、 全血轉(zhuǎn)錄組特征沿 COVID-19 疾病軌跡動態(tài)變化

接下來分析了 13 個住院患者的全血轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，從較多 5 個時間點開始與恢復(fù)對照進行比較，并將特征與 14 個健康對照進行比較。在健康對照和 COVID-19 患者之間，在對照與每種疾病軌跡假時的成對比較中，共有 5,915 個基因差異表達。與健康對照組相比，COVID-19 患者中大多數(shù)差異表達基因（DEG）的表達水平更高。早期變化包括免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄本（IGHA1 和 IGHG1）和乳鐵蛋白（LTF）的增加，而編碼 Th17 特異性轉(zhuǎn)錄因子（TF）和 II 類 HLA 轉(zhuǎn)錄本的 RORC mRNA 水平在整個病程中均下降。IL-1β 和血管舒張信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的基因在增量軌跡中（擬時序 1）高表達。從逐漸恢復(fù)到晚期恢復(fù)期（擬時序 1、3 和 4），編碼核糖體結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄物大量減少，這可能反映了 I 型干擾素對蛋白合成裝置的普遍抑制。相反，在疾病活動高峰期，與 IFN 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯著增加，但是在關(guān)鍵疾病類別中卻受到抑制。通過構(gòu)建代謝模型，發(fā)現(xiàn)與康復(fù)和健康個體相比，炎性疾病狀態(tài)與更高數(shù)量的預(yù)測代謝活性途徑相關(guān)。

圖 3  COVID-19 中全血基因表達的動力學

4、縱向共表達模塊可確定關(guān)鍵疾病中干擾素應(yīng)答的受損 以及血栓和紅細胞生成增加的特征

作者使用從成對和縱向分析（6,317 個基因）的組合中識別出的所有 DEG 進行加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析。分析確定了共 10 個共表達基因的模塊，M1-M10，它們在整個 COVID-19 疾病階段遵循不同的表達方式。評估模塊與 scRNA-seq 結(jié)果的細胞類型和臨床參數(shù)之間的個體相關(guān)性 C。在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)上預(yù)測每個模塊的 hub 基因的表達，揭示了細胞類型和擬時序特異性表達模式。基因集富集分析揭示了每個模塊中富集的生物學過程和途徑。

圖 4 差異表達基因的共表達分析和甲基化變化的整合

5、全血 DNA 甲基化分析揭示了與基因表達相關(guān)的 COVID-19 中的全基因組低甲基化

與健康對照進行成對比較，在擬時序之間鑒定出 46,071 和 69,733 個差異甲基化的 CpG 位點，與健康對照相比，每個時間點都存在大量的低甲基化位點。細胞反卷積分析鑒定出與 COVID-19 相關(guān)的 DNAm 基因的主要部分來自粒細胞，B 細胞，NK 細胞和單核細胞。

圖 5  COVID-19 的全基因組 DNA 甲基化

6、 整個 COVID-19 疾病軌跡的成漿細胞和 B 細胞變化

將 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中 22190 個 B 細胞提取出來，將 B 細胞細分，其中包括 11509 個記憶 B 細胞，3993 個 na?ve B 細胞，383 個過渡性 B 細胞和 6,295 PB 細胞。在 COVID-19 期間，PB 在很大程度上處于擴張狀態(tài)，在高炎癥期處于高水平；富集分析發(fā)現(xiàn) PB 中代謝通路顯著富集。來自炎癥狀態(tài)的 PB 表現(xiàn)出較高的代謝活性，僅在恢復(fù)時才降低，而記憶和 na?ve B 細胞在疾病狀態(tài)之間的總體代謝活性上沒有顯示出顯著差異。PB 中增加的代謝過程是氧化磷酸化，乙醛酸和二羧酸酯代謝，NAD 合成以及各種氨基酸代謝途徑（包括甘氨酸，絲氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸）的增加。預(yù)計糖酵解在炎癥疾病階段具有低活性狀態(tài)，而在臨床恢復(fù)中則具有很高的活性（擬時序 6）。該分析確定了 PBs 的廣泛活化，并暗示了細胞向氨基酸代謝的強烈的免疫代謝轉(zhuǎn)變，這可能有助于重癥 COVID-19 中所見的免疫病理學。

圖 6 B 細胞亞群細分

7、 巨核細胞數(shù)量升高是 COVID-19 的全身炎癥反應(yīng)的特征

將 5,870 個巨核細胞分成兩個亞群，HSC 和 MEP，與健康對照組相比，恢復(fù)期的 HSC 和 MEP 顯著增加，在危重患者中觀察到偽編碼丙酮酸激酶的 PKM 轉(zhuǎn)錄量（PKM2）大量增加，并與 HIF1A 相互作用并促進其活性（擬時序 2）。在這一組中，還存在高表達的 FCER1G，它編碼負責整合素（ITGA2-GP6）介導的血小板粘附的常見 FcRγ 鏈銜接子。盡管與健康對照組比較其水平低于 PBs，但是代謝建模確定了 MKs 沿疾病軌跡增加的代謝活性。預(yù)測過程與能量代謝（丙酮酸代謝，糖酵解和活性氧 [ROS] 解毒）顯著相關(guān)。

圖 7 巨核細胞水平升高是 COVID-19 的特征

文章提到細胞類型的 marker