Visium 空間轉錄組是在組織原位檢測全轉錄組基因表達的一種技術，使得我們在檢測基因表達水平的同時，獲得基因在組織內部空間表達的位置信息。與空間轉錄組相比，傳統的全基因轉錄組或單細胞轉錄組測序，丟掉了基因或細胞在組織內的空間分布信息，而廣泛應用的 RNA 探針雜交，這只能同時檢測有限的幾個基因在組織內的空間表達分布。而空間轉錄組可以將基因表達與 H &E 染色的結果疊加在一起，不需要對組織進行消化，從而保留了組織內部的空間結構，這樣使得我們可以研究組織內部不同區域的細胞異質性。

Visium 空間轉錄組的工作原理？

Visium 基因表達玻片上有 4 個捕獲區域，也就是圖片上展示的 4 個小方框，每個捕獲區域的大小是 6.5mm 乘 6.5mm，每個捕獲區域大約有 5000 個 spot，也就是圖上所示的小圓點，每個 spot 的直徑是 55μm，兩個 spot 的中心點的距離是 100μm，每個 spot 上面有數百萬條 oligo。每個 spot 上所有 oligo 的 Spatial Barcode 的序列都是相同的，而不同的 spot 之間 Spatial Barcode 是不同的，這樣通過 Spatial Barcode，就能夠知道每條 mRNA 到底位于哪個 spot，也就獲得了 mRNA 的空間位置信息。UMI 用于基因表達定量，可以知道每個 spot 上有哪些基因表達以及他們的表達量。poly- A 用于捕獲 mRNA。4 個捕獲區域內的 Spatial Barcode 是相同的，但每個捕獲區域內不同的 spot 之間 Spatial Barcode 是不同的。

公司內部空間轉錄組實驗流程？

總實驗流程分為三個部分：           

一是樣本制備及預實驗，二是組織優化，三是基因表達。

樣本制備及預實驗實驗流程：           

首先獲取組織樣本，進行冷凍，OCT 包埋，將包埋好的組織進行冰凍切片，將切好的組織放置于常規玻片上。接下來對組織切片進行固定，H&E 染色，用帶掃描功能的顯微鏡對組織切片進行明場拍照。同時切 10 片厚度為 10 μm 的冰凍切片，提取 RNA，通過計算 RIN 值來評估其質量。為了獲得先進的實驗結果，建議用 RIN 值大于 7 的組織塊做 Visium 的實驗。

組織優化的實驗流程：          

首先對 OCT 包埋的組織進行冰凍切片，將切好的組織放置于組織優化玻片上的捕獲區域。接下來對組織切片進行固定，H&E 染色，用帶掃描功能的顯微鏡對組織切片拍照，拍照完成后會繼續對組織切片進行通透處理，使細胞內的 mRNA 釋放出來，被玻片上的 oligo 所捕獲，在合成一鏈 cDNA 的時候，摻入帶有熒光基團的堿基，這樣合成好的 cDNA 就帶有熒光，接下來會通過酶消化去除玻片上殘留的組織，暴露帶有熒光的 cDNA，用 Cy3 通道的熒光顯微鏡，掃描整張片子，獲得熒光染色的圖片，組織優化的所有實驗都在玻片上完成。

基因表達實驗流程：    

先對 OCT 包埋的組織進行冷凍切片，將切好的組織切片放置于基因表達玻片上的捕獲區域。接下來對組織切片進行固定，H&E 染色，用帶掃描功能的顯微鏡對組織切片進行拍照，獲得組織形態信息。拍照完成后會繼續對組織切片進行通透處理，使細胞內的 mRNA 釋放出來，被玻片上的 oligo 所捕獲，在玻片上進行一鏈和二鏈 cDNA 的合成，合成二鏈 cDNA 后會做變性處理，將合成好的二鏈 cDNA 回收到 ep 管中，后面的所有實驗都在 ep 管中完成，包括 cDNA 的擴增和文庫的構建。空間基因表達實驗可以分為兩個部分，首部分從組織固定到二鏈 cDNA 的合成，都是在基因表達玻片上完成。次部分從 cDNA 的擴增到文庫的構建，都是在 ep 管中完成。

福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織是否與 Visium 兼容？

目前只有包埋在 OCT 中的新鮮冷凍組織經過了 Visium 空間基因表達解決方案的驗證。10X Genomics 的研發團隊成員正在積極研究 FFPE 組織相關的應用，并且已經獲得一些初步結果，推出適用于 FFPE 組織的實驗方案。

組織是否可經過 IHC 染色？

目前，Visium 空間基因表達流程是針對 H &E 染色而優化的。將 IHC 染色整合到此流程中是 10X Genomics 研發團隊積極研究的另一個領域，預計在 2020 年上半年推出。

H&E 染色是否會對樣本 RNA 質量產生影響？

不會，10X Genomics 官方實驗結果表明，H&E 染色不僅不會對樣本 RNA 質量產生影響，染色后還會提高基因檢測數。

組織或切片樣本的轉運？

運輸組織樣本：將凍存好的組織放在密封的容器中，再將裝有冷凍組織的容器用密封袋封好，放置于干冰中運輸，樣本到達目的地后迅速轉移到 -80℃冰箱保存。

運輸已經貼了組織切片的玻片：可以將玻片放置于密封的容器中，并將玻片固定好，再將裝有玻片的容器用密封的袋子封好，放置于干冰中運輸。同樣樣本到達目的地后，迅速轉移到 -80℃冰箱進行保存。這里還要注意，一旦玻片上貼好了組織切片，只能保存 7 天。

Visium 空間轉錄組目前不能夠做什么組織樣本？

在 10X 測試過的組織類型中，有三種組織還需要進一步的優化，包括樣本制備的優化和組織通透性的優化，分別是皮膚，胰腺和骨組織。

Visium 空間轉錄組能夠做何種組織類型以及推薦切片厚度是什么？

10X Genomics 測試過很多組織類型，大多數都可以用于空間轉錄組的分析。下圖是他們官網上測試過的組織類型的列表，測試過的組織都可以運用在空間轉錄組的分析上面。但建議用戶用基因表達玻片做正式實驗前，務必用組織優化的玻片測試一下，看組織能否用于空間轉錄組的實驗，同時也找到好的組織通透時間。

切片厚度基本上以 10μm 為主，但也有少量組織例外。

一張 Visium 空間基因表達玻片上可以運行不同類型的組織嗎？

可以，Visium 空間基因表達玻片上可以檢測不同類型的組織。每張玻片包含 4 個捕獲區域，因此一張玻片上至多可檢測四種不同類型組織的切片。每種組織的透化時間需要通過組織優化（TO）實驗來預先確定，每種類型的組織使用一張 TO 玻片。

一個捕獲點可以捕獲不止一種類型的細胞嗎？

是的，根據組織中待研究的具體區域，帶條形碼的捕獲點可能覆蓋不止一種類型的細胞。具體取決于組織類型、組織內的細胞大小以及這些細胞的密度。研究人員可看到每個點大約捕獲 1 到 10 個細胞。您可以將每個捕獲點想象為一種“微型批量”的實驗，在這個實驗中，研究人員收集一小批細胞的平均基因表達數據。這是 10x Genomics 的研究團隊正在積極研究的另一領域，目的是盡量讓捕獲點變得更小。

如果有些捕獲區域未使用，那么 Visium 空間組織優化或基因表達玻片是否可以重復使用？

無論您在處理過程中是否使用了所有捕獲區域，玻片僅供一次性使用。這是因為流程中包含了多個步驟，包括對玻片進行染色、沖洗和重新干燥，這些步驟會破壞未使用的捕獲區域上的寡核苷酸條形碼，并降低其整體的靈敏度。

成像測試玻片的作用？

Visium 配件試劑盒中的成像測試玻片有兩個用途。

一，確定客戶的成像系統是否與 Visium 兼容。

二，用于成像程序的設置，以便在 Visium 組織優化和基因表達流程中獲取圖像。

如何確定組織切片的空間位置信息？

在捕獲區域四周有一圈由灰色小點組成的基準邊界，提供組織切片的空間定位信息。

Visium 空間轉錄組對測序讀長的要求？

Visium 空間轉錄組的文庫，可以在 Illumina 所有測序儀上測序，文庫的結構如下圖所示，需要雙端 index 測序。

建議的測序方式是為 Read 1：28 個 bp，i7 index：10 個 bp，i5 index：10 個 bp，Read 2：120bp。Read 1  用于測試 Spatial Barcode 和 UMI，Read 2 用于測試插入片段。不建議將 visium 的文庫與其他單 index 的 10x 文庫混合測序。

Visium 空間轉錄組對測序深度的要求？

與單細胞實驗不同，我們無法根據細胞數計算空間轉錄組文庫的測序量，因為我們不知道組織切片當中有多少細胞，我們根據組織切片占捕獲區域的比例計算測序量，計算測序量的時候，只考慮被組織切片覆蓋的 spot，每個 spot 的推薦底限起始測序量是 5 萬個 read pairs，根據 H &E 染色的結果可以估算捕獲區域到底有多少百分比的 spot 被組織覆蓋。

計算測序量很簡單，比如我們假設一個組織覆蓋了捕獲區 50% 的面積，我們就用 0.5×5000×5 萬個 read pairs per spot，得出測序量是 125 個 million read pairs。這里面 0.5 就代表著覆蓋了捕獲區域 50% 的面積，5000 就代表著每一個捕獲區域總共有 5000 個 spot，再乘以 5 萬，5 萬就是每個 spot 我們推薦的底限測序的量，就是 5 萬個 read pairs per spot。測序量與組織大小、組織類型和基因表達水平相關。

在分析數據時是否需要編程或生物信息學的經驗？

通常，研究人員需要具備一點點生物信息學經驗來使用 Space Range。Space Range 流程在 Linux 服務器上運行；這就需要研究人員了解基本的命令行操作，以及如何登錄和退出 Linux 服務器。不過，在大多數情況下，Space Range 是高度自動化的。讓軟件正常運作的文件和算法都已經包含在內。因此，研究人員只需在測序后將兩個輸入文件提供給 Space Range，讓軟件生成空間基因表達數據。

Loupe Browser 有著完全圖形化的界面，并且根本不需要編程。不過，您在研究過程中可能會碰到某個時刻，比如想了解空間基因表達數據的一個具體問題，或者創建一個自定義圖形。那么，這就需要您學習 R 語言或其他腳本編程語言。

我已經對舊版本的空間轉錄組學（Spatial Transcriptomics）數據進行了測序，可以用 Space Range 和 Loupe Browser 來分析這些數據嗎？

抱歉，不可以。因為數據類型不同，它們無法兼容。如果您有這種類型的數據，仍然建議您使用現有的處理空間轉錄組學數據的分析流程。

是否有類似于 Seurat 的第三方 R 語言工具來分析空間基因表達數據？

沒錯！事實上，分析空間基因表達數據的第三方工具的數量正在迅速增長。目前的一些選擇包括 Spaniel 和 Giotto。Seurat 也是一種選擇。Space Range 流程的輸出矩陣與 Cell Ranger 的 Feature Barcode 輸出矩陣的格式相同。研究人員可將此輸出文件直接輸入 Seurat 中進行進一步的分析。您可以通過 https://satijalab.org/seurat/v3.1/spatial_vignette.html 了解 Seurat 流程處理空間基因表達數據的更多信息。

此外，10x Genomics 的計算生物學家還創建了 R 資源，可以幫助客戶對其樣本開展深度分析。這些 R 資源讓研究人員能夠一次觀察多個基因、樣本或特征，如基因、UMI 和聚類。如果研究人員想分析不同特征的樣本，或不同實驗條件下的樣本（如野生型、患病和治療中的樣本），這可能特別有用。您可以在我支持網站上訪問這些 R 資源（https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/rkit)。

伯豪生物 空間轉錄組測序服務優勢

高質量切片：切片、貼片經驗豐富，針對不同組織優化了解決方案。

流程化分析：完善的分析流程，準確快速解析空間轉錄組數據。

標準化內控：豐富的實操經驗構建了標準化的內控體系。

專業化團隊：資深的技術團隊具有多年項目方案設計、實驗操作、售后分析等經驗。

全流程服務：提供組織冷凍包埋、貼片、切片、透化、建庫測序及數據分析的全套服務。

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