乳腺癌是發生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，它是威脅全球女性健康的嚴重的常見的惡性腫瘤之一，近年來的發病率與死亡率也逐漸升高。因此，尋找和發現有價值的乳腺癌生物標志物已經成為目前研究的一個重要方向。小編這次為大家分享兩篇關于研究乳腺癌 DNA 甲基化標志物的文章（IF > 10）， 利用多組學數據分別從兩個方向篩選甲基化標志物的研究。

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易感基因 BRCA1 和 BCRA2 通過同源重組（Homologous Recombination，HR）對 DNA 進行修復，當 BRCA1 和 BCRA2 發生致病性突變，導致同源重組缺陷（HR-deficient，HRD)，損傷的 DNA 難以得到修復，容易導致三陰性乳腺癌（TNBC）等惡性腫瘤的發生。40% - 70% 的 TNBC 腫瘤具有 HRD 表型，且 BRCA1/ BRCA2 突變的乳腺癌被認為比非 HR 缺陷瘤更具免疫原性。有研究表明，增加免疫原性可以起始更好的免疫檢查點的連鎖反應，但是這一機制仍不明確。瑞典隆德大學今年 7 月份在 Nat Commun（IF 12.121）上發表了《Comprehensive molecular comparison of BRCA1 hypermethylated and BRCA1 mutated triple negative breast cancers》， 通過全面比較 BRCA1 高甲基化和 BRCA1 突變的 TNBC 患者的分子生物學特征，以確定 BRCA1 甲基化水平在 TNBC 中的功能。

作者利用已經報道的 237 例未分群的三陰性乳腺癌（TNBCs）患者（SCAN-B）以及 54 例 BRCA1 突變腫瘤患者的 WGS、RNA-seq、WGBS、 焦磷酸測序數據， 分析了早期 TNBC 中 BRCA1 啟動子高甲基化的頻率，和 BRCA1 功能缺失（體細胞 / 種系突變、BRCA1 缺失）的腫瘤表型及其與臨床病理變化、分子亞型和患者預后的關系。作者發現，在早期未分群的 TNBC 中，BRCA1 高甲基化的發生率是 BRCA1 功能缺失腫瘤的兩倍，并且在腫瘤高甲基化患者的外周血 DNA 中可以檢測到 BRCA1 啟動子甲基化的升高。此外，從突變、表觀遺傳學、轉錄和免疫浸潤表型分析中發現，BRCA1 高甲基化與 BRCA1 功能缺失患者的腫瘤表型幾乎相同。與非 BRCA1 失活的 TNBC 患者相比，輔助化療后 BRCA1 高甲基化和 BRCA1 功能缺失患者的預后更好， 說明 BRCA1 高甲基化很可能是早期 TNBC 發生的生物標志物。

結果展示

圖 1. BRCA1 高甲基化，基因表達和 HRD 關聯分析。作者通過對 235 例 TNBC 患者 BRCA1 啟動子的焦磷酸測序結果和 237 例 TNBC 患者 BRCA1 mRNA 結果分析發現，高甲基化的 BRCA1 顯著抑制了 mRNA 的表達。HRD 關聯分析發現，BRCA1 缺陷癌癥的典型特征是重排和微同源性缺失。且 WGS 結果表明，腫瘤細胞含量與 CpG 位點甲基化線性相關。這些結果顯示，BRCA1 高甲基化比 BRCA1 缺失病例的發生頻率高 2.3 倍，比 BRCA1 種系改變的發生頻率高 3 倍。同時，作者對致病性的 BRCA2 雙等位基因變異患者 PD35990a 進行分析發現，其腫瘤是以 BRCA1 缺陷為特征的 BRCA1 高甲基化增加和 BRCA1 LOH（loss of heterozygosity）等特點。

圖 2. 外周血 BRCA1 甲基化、基因表達亞型和治療后的預后。通過對 TNBC 患者年齡以及外周血甲基化分析顯示，年輕患者（50 歲以下 TNBC 患者中 46.2%) 的 BRCA1 高甲基化頻率較高，說明 BRCA1 高甲基化可能是 TNBC 患者的潛在致病因素。接著，作者用 Cox 分析和 KM 分析統計了 BRCA1 高甲基化患者和非 BRCA1 患者的生存情況，發現 BRCA1 高甲基化患者預后會更好。 說明 BRCA1 高甲基化患者預后改善的原因可能與 HRD 表型有關。

圖 3. BRCA1 高甲基化和 BRCA1 缺失的 TNBC 患者的遺傳表型比較。分別對 BRCA1 高甲基化和 BRCA1 缺失的 TNBC 患者的基因組拷貝數改變頻率、驅動基因拷貝數擴增頻率、驅動基因突變（插入、缺失、替換）的頻率，兩組樣本的取代、indels 和重排總數以及包括兩種 BRCA1/BRCA2 相關標記（RS3 和 RS5) 的六種重排標記和層次聚類、主成分分析進行比較，發現 BRCA1 高甲基化和 BRCA1 缺失的 TNBC 患者分子生物學特征接近。

圖 4 . BRCA1 高甲基化和 BRCA1 缺失的 TNBC 的 DNA 甲基化和轉錄特征。25 例 BRCA1 缺失和 57 例高甲基化 SCAN- B 病例的甲基化數據進行了比較，差異甲基化分析確定了 32 個顯著的 CpGs 且都與 BRCA1 相關。對 32 個 CpGs 的聚類分析發現在 235 個 TNBC 患者中，BRCA1 高甲基化和非甲基化的 TNBC 有明顯差異。轉錄組無監督聚類和主成分分析顯示，BRCA1 高甲基化和 BRCA1 缺失的 TNBC 患者的基因表達無明顯改變。

圖 5. BRCA1 高甲基化和 BRCA1 缺失的免疫細胞浸潤表型。在免疫組化實驗中評估 53 例 BRCA1 高甲基化和 25 例 BRCA1 缺失患者的 PD-L1 評分，結果顯示無顯著差異。

（https://doi.org/10.1038/s41467-020-17537-2）

DNA 甲基化在乳腺癌的發展過程中起著關鍵作用。之前的研究已經發現，白細胞中的 DNA 甲基化修飾可以作為一種很有前景的乳腺癌生物標記物。然而，以前的研究普遍被低統計效力和潛在的偏差限制。今年 3 月份牛津大學在 J Natl Cancer Inst（IF 11.577）上發表了一篇《Genetically Predicted Levels of DNA Methylation Biomarkers and Breast Cancer Risk: Data From 228951 Women of European Descent》， 建立了一種新的機器學習方法可以識別乳腺癌中的甲基化標志物。

研究思路

分析結果如下：

作者首先使用來自 Framingham（FHS）心臟研究中心的 1595 例患者 450K 芯片的 DNA 甲基化數據集中的多個 SNP 數據，建立統計模型來預測白細胞 DNA 甲基化標志物的水平，再使用來自 Women’s Health Initiative（WHI）的 883 患者的數據進一步對預測模型進行了驗證。接著，將模型應用于 122977 例乳腺癌患者和 105974 例對照的 GWAS 數據集中，以評估所預測的 CpGs 位點的 DNA 甲基化水平是否與患乳腺癌風險相關。結果發現，在所檢測的 62938 個 CpG 位點中，450 個 CpGs 位點與乳腺癌風險在統計學上顯著相關，其中包括 45 個以前沒有報道過的位于 18 個基因組區域的 CpGs 位點。其余 405 個 CpGs 位點位于 70 個被 GWAS 鑒定為乳腺癌風險變體的上下游 500Kb 區域內，另外 11 個 CpGs 位點獨立于被 GWAS 鑒定的變異體外。 通過對 SNP 數據、DNA 甲基化和基因表達數據的綜合分析，發現 38 個 CpGs 位點可能會通過調節 21 個基因的表達來影響患乳腺癌風險。 其中，GSTM4、SLC22A5 和 IMP3 3 個基因中有 5 個 CpGs 均位于 GWAS 中與乳腺癌風險不相關的基因組區域。GSTM4 過表達有助于維持細胞色素 c 的降低狀態，從而增加乳腺癌細胞對甲氨蝶呤的抵抗。有報道稱，SLC22A5 突變可增強乳腺組織的癌細胞轉移。在 BRCA 突變的浸潤性乳腺癌中發現了 IMP3 的表達增加。CD160 與細胞抗癌活性有關，有三個 CpGs 位于 CD160 中，通過下調 CD160 的表達，增加患乳腺癌的風險。另外有 3 個 CpGs 位于 MAPT 中，與乳腺癌轉移有關。

（https://doi: 10.1093/jnci/djz109）