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隨著結構基因組學研究的不斷深入，基因組學的研究已經進入結構基因組學時代。結構基因組學主要是在基因組范圍內通過人為改變生物體或細胞內基因的序列或表達狀態，觀察干預后的表型，從而建立基因型與表型間的關聯，闡述基因的功能。

今年五月底在 Cancer cell 上發表了一篇關于功能基因組學在研究癌癥藥物靶標領域的綜述，概述了癌癥藥物靶標篩選的不同體系，強調出不同體系之間的優缺點，并對未來癌癥研究的工作做出展望。

功能缺失型篩選是通過人為下調靶基因的表達水平和功能活性，觀察表型的改變，從而鑒定出與特定表型相關的一組基因。

Cas9 或 Cas12a 核酸酶可通過雙鏈 DNA 斷裂和隨后目標外顯子（即灰色塊）內的錯義修復引起功能缺失效應；使用 dCas9-BE，可以對目標 DNA 進行化學修飾，在編碼序列的特定位點產生終止密碼子；通過 CRISPRi 的作用可以抑制轉錄，dCas9-suppressor 會在基因轉錄起始位點附近的染色質或 DNA(即藍色高亮顯示的啟動子 / 增強子 DNA) 添加抑制標記；病毒載體和轉座酶的基因組整合可以將破壞性的轉基因添加到編碼序列中；mRNA 可以被裝載 siRNA 的 RNA 誘導沉默復合物（RISC) 或 gRNA 引導的 Cas13 核酸酶的靶向降解。

功能獲得型篩選

功能獲得型篩選是通過在細胞內上調靶基因的表達水平，并觀測表型改變，建立基因與表型之間的聯系，闡述基因功能及相互作用網絡。

功能獲得表型可以通過將 dCas9 激活因子融合靶向基因的啟動子，經 CRISPRa 技術獲得；病毒載體能夠隨機將組成型表達或誘導表達的 ORFs/cDNA 整合到基因組中；使用病毒載體和轉座酶也可以隨機整合啟動子序列，從而激活附近基因的表達。

功能修飾型篩選

功能修飾型篩選是對目的蛋白的編碼基因進行改造，在短時間內獲取靶位點氨基酸分別被其他 19 種天然氨基酸所替代的突變子的一種點飽和突變技術。

基于 dCas9 – BE 介導的編碼序列突變，會引起目的蛋白功能活性的改變；引入帶有單核苷酸變異（SNVs）的 ORFs 的病毒載體；或引入特定模板結合 Cas9 介導的 DNA 損傷的同源定向修復（HDR) 引入突變。

小編在這里對 RNAi 和 CRISPR 介導的幾種篩選體系進行了簡單的比較，如下圖所示：

上面所提到的，關于位點插入突變 / 激活篩選技術只適用于在單倍體細胞模型中篩選細胞適合度基因（cellfitness gene）。當然，隨著二代測序的發展，這種突變技術的應用能力也將會進一步提升。

那么如何選擇點陣式篩選和混合式篩選呢？

在實驗中為了獲得更加可靠的結果，往往會將混合式篩選所得到的的基因再通過點陣式文庫驗證。

怎么選擇 Knock down、Knock out 或過表達技術呢？

某些基因 Knock down 后，往往表型不明顯，這時候選擇 Knock out 會使其表型更加明顯。然而對于細胞存活重要的基因，一旦被 Knock out 往往無法觀察細胞其他的表型。且對于多拷貝基因，當選用 CRISPR/Cas 體系進行 Knock out 后，會在基因組產生多個雙鏈斷裂，過多的 DNA 斷裂會導致細胞死亡，增加癌細胞錯誤篩選的風險，導致假陽性結果，這時候應該優先考慮選擇 Knock down 技術。由于基因組的基因存在功能冗余，僅僅下調單個基因的表達，可能無法觀察到表型，導致假陰性結果，這時我們可以選擇在同一細胞內下調多個基因表達，除了操作難度很大，同時可能會像前面所說的過多的 DNA 斷裂會導致假陽性結果的產生。我們也可以選擇將功能具有冗余的基因過表達觀察表型的改變。此外，在研究特定通路與藥物協調作用的機制上過表達篩選技術具有不可以替代的作用。值得注意的是，用過表達技術去驗證 Knock down/out 的表型時，同一基因 Knock down/out 的表型與過表達的表型也不總是相反的，可能存在一致的情況，可能是由于目的基因表達的蛋白是以復合物的形式發揮功能。

小結

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