發表期刊：J Clin Invest

影響因子：IF=11.57

伯豪公司提供的產品或服務：Human circRNA 芯片

尿病視網膜病變（DR) 是處于工作年齡的成年人失明的主要原因。其中，血管周細胞變性是主要的臨床表現。然而，控制周細胞變性的機制卻不明確。環狀 RNA (Circular RNAs, circRNAs) 已被發現在多種生物過程和疾病進展中起重要作用。本研究中，作者研究了 circRNA 在周細胞生物學和糖尿病視網膜血管中的作用。研究發現，糖尿病患者外周血細胞中 cZNF532 表達上調；在糖尿病小鼠模型的視網膜血管中和糖尿病患者的玻璃體中，cZNF532 表達也同樣上調。進一步分析其功能發現，cZNF532 沉默會導致周細胞的存活率，增殖和和分化能力降低。在體外實驗中，cZNF532 還可以抑制周細胞向內皮細胞的募集。cZNF532 可以作為 miR-29a-3p 海綿并誘導 NG2，LOXL2, CDK2 的表達來調控周細胞生物學功能。下調 cZNF532 或過表達 miR-29a-3p 加重鏈脲霉素誘導的視網膜周細胞變性和血管功能障礙。相反，過表達 cZNF532 或抑制 miR-29a-3p 可改善糖尿病玻璃體誘導的視網膜周細胞變性和血管功能障礙。總的來說，該研究證實了 circRNA 在 DR 中介導的周細胞生物學的機。誘導 cZNF532 或拮抗 miR-29a-3p 可能成為將來治療 DR 的新方法。

結果

1. 在周細胞中，高糖可以顯著上調環狀 RNAcZNF532 的表達

通過 circRNA 芯片檢測高糖處理和正常對照的周細胞的 circRNA 表達，共篩選到 1523 顯著差異表達的 circRNAs，其中包含 625 個上調的 circRNAs 和 898 個下調的 circRNAs。通過 qPCR 進一步驗證 top5 上調和 top5 下調的 circRNAs 發現，circ_0047814 是上調較多的 circRNA。該 circRNA 是由 ZNF532 轉錄而來的。Sanger 測序確定其在周細胞中為組成型表達。該 circRNA 可以抵御 Rnase 酶的消化。并且發現該 circRNA 主要在周細胞的細胞質中表達，預示著其可能會作為 ceRNA，來參與周細胞的生物學調控。動物實驗和細胞實驗同樣證實了 cZNF532 在高糖誘導下會顯著上調。

為了進一步確認 cZNF532 的調控機制，作者運用 TRANSFAC database 進行上游轉錄因子的預測，結果顯示，其有多個轉錄因子結合位點，其中包括與糖尿病的發病相關的轉錄因子 SP1.

2. 體外實驗證實 cZNF532 可以調節周細胞功能

周細胞是多能的干細胞和 / 或祖細胞，可以分化為多種不同的細胞類型。cZNF532 siRNA1 沉默 cZNF532 降低了周細胞標記物的表達，包括血小板衍生生長因子受體（PDGFR)- 細胞增殖、血清 - sma、Desmin 和 NG2(圖 2A)。周細胞 - 內皮細胞的 corsstalk 對血管穩態的穩定至關重要。而且內皮細胞屏障的正常功能需要周細胞募集。基質共培養檢測顯示，cZNF532 沉默降低了 HRVECs 周細胞募集（圖 2B)。與對照組相比，周細胞 cZNF532 沉默增加了大分子的通透性。然后作者確定異常的周細胞分化和募集是否與改變細胞活力或增殖有關。MTT 和 Ki67 染色顯示，沉默 cZNF532 降低了周細胞的活力和增殖能力。流式細胞術檢測細胞周期結果顯示，與野生型對照組相比，沉默 cZNF532 周細胞 S 期細胞減少 3 倍，g1 期細胞增加約 30%。PI 染色和 caspase 3/ 7 活性檢測顯示，沉默 cZNF532 可加重高糖或氧化應激誘導的細胞凋亡，表現為 caspase 3/ 7 活性增加，PI 陽性細胞增多。

3.cZNF532 在體內調節視網膜周細胞功能和血管完整性

單獨沉默 cZNF532 (cZNF532 shRNA) 或單獨糖尿病（DR) 可在 2 個月、4 個月和 6 個月時降低視網膜周細胞的覆蓋。合并 cZNF532 沉默和糖尿病進一步降低了視網膜周細胞的覆蓋。結果表明，cZNF532 沉默和糖尿病協同調節周細胞的覆蓋。采用 Evans 藍法檢測視網膜血管滲漏。在 1 個月、2 個月、4 個月和 6 個月時，作者發現實驗因素 cZNF532 沉默和糖尿病協同加重糖尿病引起的視網膜血管滲漏，這與 cZNF532 調整周細胞覆蓋的結果相似。

4.cZNF532 在體外作為 miR-29a-3p 的海綿調節周細胞功能

由于 cZNF532 主要表達在周細胞的細胞質中，作者推測 cZNF532 在轉錄后水平上作為 miRNA 海綿調控周細胞功能。作者通過 TargetScan 算法，尋找 Cznf532 所能吸附的 miRNA。熒光素酶活性篩選顯示，miR-29a-3p、miR-498 和 miR-758 模擬轉染降低熒光素酶活性 LUC-cZNF532。FISH 檢測顯示，cZNF532 和 miR-29a-3p 在周細胞細胞質中重疊共表達。進一步采用熒光素酶活性測定法研究 cZNF532 能否與 miR-29a-3p 結合。過表達 cZNF532 或 anti-miR-29a-3p 逆轉了 mir -29a-3p 介導的對熒光素酶活性的抑制。而不能產生 cZNF532 的 cZNF532 載體由于 cZNF532 產量低或循環效率低，影響較小。此外，作者還發現，轉染 miR-29a-3p inhibitor 或 mimic 并沒有改變周細胞中 cZNF532 和 ZNF532 mRNA 的表達。這些結果表明，cZNF532 只是作為 miR-29a-3p 的海綿，通過將 miR-29a-3p 從其靶基因中隔離出來，從而降低 miR-29a-3p 的活性。

5.cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2 網絡調節周細胞功能和血管完整性

然后作者在體內研究了 miR-29a-3p 在視網膜血管功能障礙中的作用。miR-29a-3p agomir 或 cZNF532 沉默導致 NG2 和 CDK2 表達增加。miR-29a-3p agomir 可模擬沉默 cZNF532 對視網膜血管功能障礙的影響。在糖尿病視網膜中，注射 miR-29a-3p agomir 降低了周細胞的覆蓋，加重了血管滲漏（圖 6C 和 6D)，增加了微動脈瘤、脫細胞毛細血管和周細胞影。

結論

該研究證實了 circRNA 在 DR 中介導的周細胞生物學的機制，誘導 cZNF532 或拮抗 miR-29a-3p 可能成為將來治療 DR 的新方法。

參考文獻

Jiang, Q., et al., Circular RNA-ZNF532 regulates diabetes-induced retinal pericyte degeneration and vascular dysfunction. J Clin Invest, 2020.

更多伯豪生物服務