上一回，我們著重講述了 有了 RNA-seq 還需要蛋白質(zhì)檢測(cè)嗎？ 其中幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)大家一定記住了吧！比如在全基因組中，mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平之間的相關(guān)性很差，在許多研究中的解釋力（explanatory power）徘徊在 40% 左右。這一回，我們來(lái)講述如何進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)。
蛋白質(zhì)檢測(cè)首先我們想到的是質(zhì)譜（(mass spectrometry）技術(shù)。
質(zhì)譜技術(shù)： 通過(guò)對(duì)化合物分子進(jìn)行電離，生成不同質(zhì)荷比（m/e）的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖。質(zhì)譜圖中的橫坐標(biāo)表示離子的質(zhì)荷比值，縱坐標(biāo)表示離子流的強(qiáng)度。
蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，在應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了很多具體的方法：
不帶標(biāo)記的 label free
帶標(biāo)記的 iTRAQ（isobarictags for relative and absolute quantitation, 同位素標(biāo)記相對(duì)和 jué對(duì)定量）
帶標(biāo)記的 TMT（Tandem Mass Tags, 串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽）
非常高級(jí)的似乎全能的 DIA（Data Independent Acquisition, 數(shù)據(jù)非依賴性采集）
低通量的 PRM（Parallel Reaction Monitoring, 平行反應(yīng)監(jiān)視）
不帶標(biāo)記的 label free
Label free 是基礎(chǔ)的了。與帶標(biāo)記的 iTRAQ 和 TMT 相比，樣本不加標(biāo)簽，每個(gè)樣本單獨(dú)上機(jī)。只分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號(hào)強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。由于它的技術(shù)原理所限，對(duì)儀器的穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)人員的操作等可能產(chǎn)生系統(tǒng)誤差的因素要求極高，進(jìn)而造成數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較差。當(dāng)然 label free 也有自己的優(yōu)勢(shì)，由于價(jià)格比較便宜，在臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)由于很多情況下都有十來(lái)個(gè)重復(fù)可以降低單個(gè)樣品定量不準(zhǔn)的風(fēng)險(xiǎn)，也就是說(shuō)那種一測(cè)大幾十個(gè)、上百個(gè)的時(shí)候還是可以選擇的。還有一種情況，部分老師僅僅是想看看蛋白“有還是無(wú)”的，也是可以用 label free 的。還另有適用情況，比如泛素化修飾檢測(cè)只能用 label free，這個(gè)我們后面講修飾組的時(shí)候再細(xì)講。
帶標(biāo)記的 iTRAQ/TMT
iTRAQ/TMT 是都是先將蛋白進(jìn)行標(biāo)記的，只是標(biāo)記的基團(tuán)不同。以 iTRAQ 舉例說(shuō)明，iTRAQ 即同位素標(biāo)記相對(duì)和 jué對(duì)定量，使用同位素對(duì)不同樣品進(jìn)行標(biāo)記，然后將同一批樣品一起上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同的同位素標(biāo)記來(lái)區(qū)分各個(gè)樣品中 不同蛋白的表達(dá)量。優(yōu)勢(shì)是：定量準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，靈敏度高對(duì)樣品要求量低，檢測(cè)蛋白數(shù)量多。缺點(diǎn)是由于同位素標(biāo)記較多的只有 16 種（對(duì)，現(xiàn)在新出了 16 標(biāo)的試劑盒！比以前同時(shí)標(biāo)記的數(shù)量增加了），樣品量大（不考慮生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)大于 16 個(gè)時(shí)）的時(shí)候需要在每次上機(jī)時(shí)加內(nèi)參樣品，增加了成本。樣品量在不是特別多的情況下，iTRAQ/TMT 是目前做蛋白定量的技術(shù)。
圖 label free(A) 和穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量（B) 之間的差異。Label free 定量包括兩個(gè)獨(dú)立進(jìn)行的分析，然后進(jìn)行比較。通過(guò)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的定量可以直接比較同位素標(biāo)記的肽對(duì)。LC-MS/MS，液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用。
非常高級(jí)似乎全能的 DIA 技術(shù)
和上面的三種技術(shù)，非常高級(jí)似乎全能的 DIA 技術(shù)是升級(jí)換代式的進(jìn)步。上面的三種，采用的是 DDA（data-dependent acquisition，數(shù)據(jù)依賴采集）數(shù)據(jù)采集方式，其策略是對(duì)響應(yīng)高的部分母離子進(jìn)行二級(jí)采集。而 DIA（Data Independent Acquisition，數(shù)據(jù)非依賴采集）采用了不同的數(shù)據(jù)采集模式：將質(zhì)譜整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)窗口，然后對(duì)每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行檢測(cè)、碎裂，從而無(wú)遺漏、無(wú)差異地獲得樣本中所有離子的信息，實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)的機(jī)槍掃射的方式向?qū)椶Z炸方式的采集方式轉(zhuǎn)變。
特別是對(duì)于血液，含有像白蛋白這樣的高豐度蛋白。在常規(guī)質(zhì)譜分析中，那些高豐度的蛋白常常會(huì)將具有意義的低豐度蛋白掩蓋。而 DIA 技術(shù)，無(wú)需去除高豐度的蛋白。
當(dāng)然，DIA 也有其弱點(diǎn)，比如對(duì)儀器的要求、價(jià)格等。所以，也不能完全取代之前的技術(shù)。要根據(jù)需求選擇。
低通量的 PRM
PRM 能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段（如發(fā)生翻譯后修飾的肽段）進(jìn)行選擇性檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì) / 肽段進(jìn)行 jué對(duì)定量。也就是說(shuō)，是靶向的定量技術(shù)。PRM 和上述的幾種技術(shù)相比，就相當(dāng)于 qPCR 之于二代測(cè)序。因此，可以用來(lái)驗(yàn)證蛋白質(zhì)組的結(jié)果。當(dāng)然，qPCR 做驗(yàn)證，一般是做的單重 qPCR，而 PRM 可以輕松上到多重，我們?cè)囘^(guò)一次檢測(cè) 50 個(gè)靶標(biāo)。我們“古早”的蛋白驗(yàn)證技術(shù)，像 Western Blot，可以被 PRM 代替的，而且 PRM 也不需要一抗。如果需要檢測(cè)的蛋白多，經(jīng)濟(jì)上算起來(lái)，PRM 更劃算呢！
當(dāng)然，基于質(zhì)譜蛋白檢測(cè)應(yīng)用發(fā)展的還有其它技術(shù)。上面介紹的 5 種技術(shù)是用得較多的。檢測(cè)蛋白的技術(shù)，可能還會(huì)想到免疫。當(dāng)然我們這里要介紹的不是 Western Blot、ELISA 等傳統(tǒng)的免疫技術(shù)，而是高通量的蛋白芯片以及低通量的液相懸浮芯片。
蛋白芯片 類似于基因芯片，固相的板面上有整齊地排列著一個(gè)一個(gè)小點(diǎn)，這些小點(diǎn)可能是各種抗體，也可能是各種基因組的蛋白質(zhì)。通過(guò)抗原抗體及顯色反應(yīng)，芯片上顯出或者亮或暗的點(diǎn)，以此篩查各種信號(hào)通路、蛋白表達(dá)。
液相懸浮芯片 ，我們前面介紹過(guò) 還不知道液相懸浮芯片？你 OUT 啦！ 在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，主要是各種細(xì)胞因子檢測(cè)，即 Merck Millipore 公司的 Milliplex 高通量蛋白因子檢測(cè)芯片。它是一塊 96 孔板，每個(gè)孔里有偶聯(lián)上不同抗體的微珠。上樣后，經(jīng)過(guò)抗原抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)，可以得出每個(gè)樣本的不同因子的量。
細(xì)胞因子（cytokines）是由免疫細(xì)胞（如單核、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等）和某些非免疫細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)，Miliplex 檢測(cè)的是各種液體，包括體液、灌洗液。
以上，我們介紹了基于質(zhì)譜和基于免疫反應(yīng)兩大類常見(jiàn)的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。下面幾回，我們會(huì)進(jìn)行一些案做的分享。 有了 RNA-seq,，還需要蛋白質(zhì)檢測(cè)嗎？
